Operon, promotor i czynnik sigma opisują trzy różne poziomy organizacji ekspresji. Operon mówi, które geny mogą znaleźć się na wspólnym transkrypcie. Promotor jest odcinkiem DNA, na którym polimeraza RNA rozpoczyna syntezę. Czynnik sigma nadaje rdzeniowi polimerazy zdolność rozpoznawania określonej klasy promotorów. Żaden z tych elementów sam nie wystarcza do przewidzenia ilości każdego białka.

Najbardziej znany schemat — promotor, operator, trzy geny i terminator — dobrze wprowadza model operonu lac, ale staje się mylący, gdy uzna się go za obowiązkowy plan bakteryjnego genu. Rzeczywiste loci mają alternatywne i wewnętrzne promotory, częściowe terminatory, antysensowne starty, przetwarzanie RNA oraz różne szybkości translacji i degradacji poszczególnych odcinków. Ten sam zestaw sąsiadujących genów może tworzyć kilka wariantów transkryptu zależnie od warunków.baj,operonseq

Mapa pojęć

Pojęcie Jednostka albo element Pytanie rozstrzygające Typowa pułapka
gen odcinek kodujący funkcjonalny produkt wraz z kontekstem ekspresji jaki RNA lub białko powstaje utożsamienie genu z samym ORF
promotor region DNA kierujący inicjacją transkrypcji gdzie i przez jaki holoenzym zaczyna się RNA uznanie każdego podobnego motywu za aktywny promotor
TSS konkretny nukleotyd startu transkrypcji oznaczany +1 jaki jest pierwszy nukleotyd pierwotnego RNA pomylenie z początkiem translacji
jednostka transkrypcyjna promotor, transkrybowany odcinek i droga zakończenia jaka cząsteczka RNA jest produktem jednej inicjacji założenie, że zawsze odpowiada adnotowanemu operonowi
operon zespół genów współtranskrybowanych co najmniej w jednym wariancie czy geny występują na tej samej cząsteczce pierwotnego RNA oczekiwanie identycznej ilości wszystkich białek
operator miejsce cis wiązania regulatora, historycznie represora jakie białko wiąże DNA i jak zmienia inicjację traktowanie operatora jako koniecznej części każdego operonu
regulon rozproszone jednostki kontrolowane wspólnym regulatorem które promotory reagują na ten sam czynnik mylenie z jednym wielogenowym transkryptem
stymulon geny reagujące na ten sam bodziec, często wieloma regulatorami jaka odpowiedź łączy je fizjologicznie przypisanie całej odpowiedzi jednemu białku
czynnik sigma wymienna podjednostka inicjacyjna polimerazy RNA jaką klasę promotorów preferuje holoenzym uznanie jego regulonu za rozłączny i stały

Granice tych zbiorów zależą od warunków. Gen może należeć jednocześnie do regulonu czynnika sigma, regulonu represora i stymulonu stresu osmotycznego. Operon jest relacją transkrypcyjną w genomie, a regulon relacją regulacyjną między wieloma miejscami.

Jednostką procesu jest transkrypcja, nie strzałka genu

Polimeraza RNA używa jednej nici DNA jako matrycy i syntetyzuje RNA w kierunku 5′→3′. Promotor ma orientację, więc wyznacza nić matrycową i kierunek ruchu enzymu. Dwa geny zachodzące na siebie na przeciwnych niciach mogą mieć osobne promotory i być transkrybowane w przeciwnych kierunkach.

Adnotacja genu zwykle pokazuje otwartą ramkę odczytu od kodonu start do stop. Pierwotny transkrypt może zaczynać się dziesiątki albo setki nukleotydów wcześniej, obejmować 5′ UTR, kilka ORF i 3′ UTR oraz kończyć się za ostatnim genem. TSS +1 nie jest pozycją kodonu inicjacyjnego i nie powinien być numerowany względem niego bez jawnego przeliczenia.

Jednostka transkrypcyjna jest konkretnym połączeniem początku, odcinka RNA i końca. Locus z dwoma promotorami i miejscem częściowego odczytu terminatora może tworzyć kilka takich jednostek. „Operon” bywa używany dla całej rodziny wariantów, dlatego w analizie eksperymentalnej lepiej podać dokładny TSS i TTS.

Operon koordynuje geny, lecz nie zrównuje ich ekspresji

W policistronowym mRNA kilka sekwencji kodujących leży na jednej cząsteczce RNA. Jest to skuteczny sposób skoordynowania enzymów jednego szlaku albo podjednostek kompleksu: jedno zdarzenie inicjacji udostępnia cały zestaw cistronów. Każdy cistron nadal może mieć własne miejsce inicjacji translacji i odmienną wydajność odczytu.

Ilości białek rozdzielają się po transkrypcji. Struktura RNA może zasłaniać jedno RBS, a odsłaniać inne; translacja pierwszego genu może otwierać miejsce startu następnego; endonukleaza może przeciąć transkrypt na fragmenty o różnej trwałości. Białka mają ponadto inne szybkości fałdowania i degradacji. Wspólne mRNA nie oznacza stechiometrii 1:1.

Polaryzacja mutacji jest praktyczną konsekwencją. Wczesny kodon stop może odsłonić RNA dla Rho i przedwcześnie zakończyć transkrypcję dalszych genów albo zaburzyć sprzężenie translacyjne. Fenotyp delecji pierwszego genu może więc wynikać częściowo z obniżenia ekspresji następnych. Konstrukcja komplementująca wyłącznie pierwsze białko nie zawsze naprawi efekt polarny.

Operon może mieć podoperony i alternatywne końce

Promotor przed pierwszym genem tworzy pełny transkrypt, a promotor wewnątrz operonu może dodatkowo zwiększać ekspresję dalszej części. Wewnętrzny terminator może kończyć część cząsteczek, pozwalając innym przejść dalej. Powstaje zestaw nakładających się RNA o różnych proporcjach genów.

Sekwencjonowanie pełnych pierwotnych transkryptów E. coli metodą SMRT-Cappable-seq wykazało, że 34% znanych operonów można było rozszerzyć co najmniej o jeden gen, a około 40% miejsc terminacji wykazywało read-through zmieniający skład wariantu operonu.operonseq Liczby dotyczą metody, organizmu i warunków, lecz dobrze pokazują, dlaczego sama bliskość genów nie wyznacza jednej cząsteczki.

Termin „podoperon” opisuje transkrypt zaczynający się wewnątrz dłuższego operonu albo jego regulacyjnie odrębną część. Nie jest odpowiednikiem alternatywnego splicingu: bakterie mogą mieć introny, ale typowa zmienność operonowa wynika z alternatywnych startów, końców, degradacji i odczytu terminatora.

Operon jednogenowy nie jest sprzecznością

Historyczna definicja podkreślała wspólną kontrolę kilku genów, lecz współczesne bazy używają „operonu” również dla jednej jednostki zawierającej pojedynczy gen. Dla precyzji można wtedy mówić o monocistronowej jednostce transkrypcyjnej. Istotne są promotor i produkt RNA, a nie minimalna liczba ORF.

Nie każdy sąsiadujący zestaw genów o podobnej funkcji jest operonem. Geny mogą mieć zgodną orientację i małe odstępy, lecz osobne promotory oraz terminatory. Z kolei odległy regulator lacI nie staje się częścią operonu lacZYA tylko dlatego, że steruje jego represją.

Rdzeń polimerazy RNA potrzebuje programu inicjacji

Bakteryjny rdzeń polimerazy RNA składa się zasadniczo z podjednostek α₂ββ′ω. β i β′ tworzą centrum katalityczne oraz zacisk wokół kwasów nukleinowych, α uczestniczą w montażu i kontaktach regulatorowych, a ω stabilizuje kompleks. Rdzeń sprawnie wydłuża RNA, ale bez czynnika inicjacyjnego nie wybiera efektywnie właściwych promotorów.

Po związaniu sigma powstaje holoenzym. Sigma ogranicza nieswoiste, długotrwałe wiązanie rdzenia z przypadkowym DNA i jednocześnie nadaje wysokie powinowactwo do właściwych układów motywów promotorowych. To nie sigma samodzielnie syntetyzuje RNA; kieruje wspólny aparat katalityczny do innej klasy wejść.

Niektóre bakterie mają dodatkowe podjednostki lub stałe czynniki związane z RNAP, na przykład δ i ε u Bacillus subtilis albo CarD w wielu innych liniach. Model α₂ββ′ωσ jest rdzeniem porównania, a nie kompletną listą wszystkich kontaktów każdego gatunku.

Promotor jest architekturą, nie jednym słowem sekwencji

Dla głównego czynnika σ⁷⁰ E. coli klasyczne konsensusy wynoszą w przybliżeniu TTGACA dla elementu −35 i TATAAT dla −10, zwykle rozdzielonego odstępem bliskim 17 par zasad. Domeny sigma 4 i sigma 2 rozpoznają odpowiednio okolice −35 oraz −10. Podczas otwierania krytyczne zasady nici niematrycowej w elemencie −10 są wywracane do kieszeni białka.saurnap

Konsensus jest statystycznym zestawieniem wielu promotorów, nie sekwencją wymaganą w każdym miejscu. Naturalny promotor może różnić się w kilku pozycjach, korzystać z rozszerzonego elementu −10, słabego −35, elementu UP wiązanego przez domeny C-końcowe α albo aktywatora kompensującego niekorzystne kontakty.

Odstęp ma znaczenie geometryczne. Dwa doskonałe heksamery oddzielone niewłaściwą liczbą zasad mogą znaleźć się po złej stronie helisy lub nie dosięgać jednocześnie domen sigma. Insercja jednego nukleotydu w spacerze może więc silnie zmienić inicjację bez zmiany żadnego „motywu”.

Pozycje promotora opisuje się względem TSS

Nukleotyd startu ma numer +1, pozycje wcześniejsze są ujemne, a klasycznie nie używa się zera. Element −10 nie musi zajmować dokładnie pozycji od −12 do −7 w każdym promotorze, bo wybór TSS i odstępy mają pewną elastyczność. Nazwa wskazuje przybliżone położenie funkcjonalne.

Między −10 a +1 leży między innymi discriminator, którego sekwencja wpływa na trwałość kompleksu otwartego i odpowiedź części promotorów na stan fizjologiczny. Za +1 znajduje się początkowo transkrybowany region; jego sekwencja zmienia wydajność pierwszych wiązań, transkrypcję abortywną i ucieczkę z promotora.

Element UP leży dalej przed −35 i może wiązać C-końcowe domeny podjednostek α. Jest szczególnie ważny w silnych promotorach rRNA, ale jego działanie zależy od kontekstu. To, że sekwencja znajduje się „przed −35”, nie czyni jej automatycznie elementem UP.

Ten sam motyw może działać inaczej w chromosomie i na plazmidzie

Superzwinięcie, sąsiednia transkrypcja, białka nukleoidowe i lokalna dawka kopii wpływają na otwieranie promotora. Reporter na wielokopijnym plazmidzie zmienia liczbę miejsc wiązania regulatora i może miareczkować LacI, CRP albo sigma. Integracja w chromosomie usuwa część tych problemów, lecz pozycja względem oriC nadal zmienia średnią liczbę kopii podczas szybkiego wzrostu.

Promotor może zachodzić na kodujący DNA innego genu, leżeć wewnątrz ORF lub być skierowany antysensownie. Mapowanie u Rhodobacter sphaeroides wykryło liczne wewnątrzgenowe TSS, co pokazuje powszechność potencjalnych startów, ale nie każdy krótki transkrypt musi mieć istotną funkcję biologiczną.card

Rozpoznanie promotora ma kilka kinetycznych progów

Holoenzym najpierw tworzy kompleks zamknięty z nadal dwuniciowym DNA. Kolejne izomeryzacje wyginają i częściowo ładują DNA do szczeliny, a stopienie okolicy −10 daje kompleks otwarty. Polimeraza rozpoczyna syntezę bez startera, zachowując na końcu 5′ pierwszego nukleotydu trifosforan.

Pierwsze krótkie RNA często są uwalniane, zanim enzym opuści promotor. Podczas takiej transkrypcji abortywnej polimeraza pozostaje zakotwiczona kontaktami promotorowymi, a wciągane DNA tworzy naprężenie nazywane scrunchingiem. Dopiero udana ucieczka z promotora osłabia część kontaktów sigma–DNA i tworzy stabilny kompleks elongacyjny.

„Siła promotora” jest złożonym wynikiem szybkości znalezienia, powstawania kompleksu otwartego, trwałości, rozpoczęcia syntezy i ucieczki. Bardzo trwały kompleks nie zawsze daje najwięcej pełnych transkryptów, jeżeli polimeraza utknie przed escape. Pomiar samego powinowactwa w EMSA nie jest pełnym pomiarem aktywności.

Sigma nie zawsze odpada natychmiast

Podręcznikowy schemat pokazuje całkowitą dysocjację sigma po syntezie około dziesięciu nukleotydów. W rzeczywistości kontakty słabną, a sigma może pozostać z częścią kompleksów podczas wczesnej, a czasem dalszej elongacji. Zachowana σ⁷⁰ może rozpoznawać podobne do −10 sekwencje w transkrybowanym DNA i powodować pauzy promotorowo-proksymalne.sigmapause

Czynnik sigma jest więc przede wszystkim czynnikiem inicjacji, lecz przejście nie jest binarnym odpadnięciem w jednym nukleotydzie. Dla interpretacji ChIP albo mikroskopii obecność sigma poza promotorami nie musi oznaczać setek nieznanych inicjacji.

Regulacja cis i trans spotyka się na promotorze

Element cis działa na tej samej cząsteczce DNA: promotor, operator, miejsce aktywatora, sekwencja wygięcia albo terminator. Nie koduje dyfundującego produktu. Czynnik trans jest cząsteczką mogącą działać na wiele kopii odpowiedniego miejsca, na przykład LacI, CRP, sigma albo małe RNA.

Mutacja promotora zwykle wpływa tylko na połączoną jednostkę. Mutacja regulatora może zmienić wszystkie jego cele. W komórce częściowo diploidalnej prawidłowy represor produkowany z jednej kopii może uzupełniać drugą, ale operator o zmienionej sekwencji nie zostaje „naprawiony” dyfundującym operatorem typu dzikiego.

Operator może zachodzić na promotor, leżeć za TSS, przed −35 albo występować w kilku kopiach. Jego pozycja determinuje mechanizm: represor może utrudnić wiązanie RNAP, tworzenie kompleksu otwartego, ucieczkę, przejście polimerazy albo kontakt aktywatora.

Represja i aktywacja nie opisują stanu genu, lecz mechanizm

Kontrola negatywna wykorzystuje regulator, którego związanie zmniejsza transkrypcję. Induktor może obniżyć powinowactwo represora do operatora, a korepresor je zwiększyć. Kontrola pozytywna wykorzystuje aktywator poprawiający rekrutację RNAP albo przejście do kompleksu otwartego.

Ten sam promotor może być jednocześnie kontrolowany negatywnie i pozytywnie. Brak represora nie gwarantuje maksymalnej ekspresji, jeżeli potrzebny aktywator jest nieaktywny. „Gen włączony/wyłączony” jest przybliżeniem ciągłej, szumnej wielkości.

Aktywator związany przed promotorem może kontaktować domenę α albo sigma; regulator związany w innym miejscu może zmienić topologię lub wygiąć DNA. Białko wiążące daleko nie musi być eukariotycznym enhancerem. W bakteryjnym σ⁵⁴ istnieją jednak rzeczywiste upstream activation sequences, z których ATPazowy aktywator kontaktuje holoenzym dzięki pętli DNA.

Operon lac łączy trzy wejścia, a nie jeden przełącznik

Operon lacZYA koduje β-galaktozydazę, permeazę i transacetylazę. LacI jest represorem kodowanym przez osobną jednostkę. Bez odpowiedniego induktora LacI zajmuje operatory i silnie ogranicza transkrypcję. Allolaktoza powstająca z laktozy wiąże LacI i przesuwa równowagę konformacyjną ku słabszemu wiązaniu operatora.

LacI jest tetramerem zdolnym związać dwa operatory i utworzyć pętlę DNA. Główny operator O1 współpracuje z pomocniczymi O2 i O3, zwiększając represję. Model z jednym prostokątem operatora nie odtwarza tej geometrii. Położenie, orientacja i odległość operatorów wpływają na skuteczność pętli.laclibrary

Drugim wejściem jest stan katabolitowy. Kompleks CRP–cAMP wiąże miejsce przed promotorem i pomaga rekrutować lub aktywować RNAP. Wysoka dostępność preferowanego źródła węgla zwykle obniża sygnał cAMP–CRP, ale określenie „glukoza wyłącza lac” jest zbyt proste: działają transport PTS, inducer exclusion, stężenie laktozy, wzrost i inne regulatory.

Pełna ekspresja wymaga zatem zarówno zniesienia represji LacI, jak i sprzyjającej aktywacji CRP. Brak laktozy daje represję niezależnie od cAMP; obecność laktozy przy silnym katabolizmie glukozy może dać tylko ograniczoną ekspresję. Tablica czterech warunków jest dokładniejsza niż jedna strzałka „laktoza → lac”.

Dodatnie sprzężenie przez LacY tworzy historię komórki

Permeaza LacY zwiększa pobieranie laktozy, a więcej induktora dalej zwalnia LacI. Pojedyncze komórki różnią się początkową liczbą cząsteczek LacY i przypadkowymi epizodami transkrypcji. Po przejściu z glukozy na laktozę czas indukcji może mieć szeroki rozkład, a nie jedną wartość populacyjną.lacsingle

IPTG i TMG są użytecznymi analogami, ale nie odtwarzają całego metabolizmu laktozy. IPTG nie jest typowo metabolizowany jak laktoza, a jego transport i stężenie wewnętrzne mają inną dynamikę. Wyniku reportera indukowanego IPTG nie należy bezpośrednio nazywać fizjologią operonu lac na laktozie.

Alternatywne promotory rozdzielają sygnały

Jeden gen albo operon może mieć kilka TSS rozpoznawanych przez ten sam lub różne czynniki sigma. Promotor dalszy tworzy długi 5′ UTR, promotor bliższy krótszy; różnica może zmienić stabilność RNA i translację. Warunki nie tylko zmieniają ilość transkryptu, ale także jego początek.

Promotory mogą na siebie zachodzić. Dwa holoenzymy konkurują wtedy o DNA, a aktywacja jednego kierunku mechanicznie tłumi drugi. Mutacja wzmacniająca jeden promotor może zatem obniżyć sąsiedni bez miejsca represora.

Gen regulatorowy może mieć promotor bazowy i autoaktywowany, tworząc próg albo pamięć. Alternatywny promotor wewnątrz genu może produkować krótsze białko, RNA regulatorowe albo transkrypt bez funkcji. Funkcję trzeba wykazać, a nie wyprowadzać z samego TSS.

Czynnik sigma przełącza preferencje tego samego rdzenia

Wiele bakterii ma podstawowy czynnik sigma kierujący ekspresją genów potrzebnych podczas zwykłego wzrostu oraz zestaw alternatywnych sigma uruchamianych w określonych stanach. U E. coli podstawowym jest RpoD, czyli σ⁷⁰; u wielu bakterii Gram-dodatnich homolog nosi nazwę SigA lub σᴬ. Liczba w zapisie sigma zwykle pochodzi od przybliżonej masy historycznie opisanej podjednostki, nie od numeru regulonu.

Alternatywny sigma nie dostarcza nowej aktywności katalitycznej. Konkuruje o ograniczoną pulę rdzenia RNAP i zmienia zestaw promotorów, na których powstaje holoenzym. Wzrost stężenia jednego czynnika może więc zwiększyć jego regulon oraz pośrednio zmniejszyć dostępność polimerazy dla innych.

Konkurencja nie jest prostym wyścigiem stężeń. Powinowactwo sigma do rdzenia, jego modyfikacje, anty-sigma, czynniki takie jak Rsd, 6S RNA, alarmony i właściwości promotorów wpływają na rzeczywisty przepływ RNAP. Część regulacji zachodzi przez syntezę sigma, część przez proteolizę albo szybkie uwolnienie już istniejącej cząsteczki.

Regulony sigma zachodzą na siebie

Promotor może być rozpoznawany przez więcej niż jeden holoenzym. Mapowanie celów σ³², σᴱ i σ⁷⁰ w E. coli ujawniło rozległe nakładanie, a nie zbiory o ostrych granicach.overlap Powtarzający się motyw przypisany jednemu sigma jest więc hipotezą preferencji, nie dowodem wyłączności.

Wzrost transkryptu po nadekspresji sigma może być pośredni: nowy regulon koduje regulator następnego poziomu, zmienia proteostazę albo odbiera rdzeń konkurentowi. Bezpośrednie cele wymagają połączenia TSS i motywu z wiązaniem RNAP–sigma oraz aktywnością in vitro lub szybką odpowiedzią bez nowej syntezy białka.

Klasyfikacja regulonu zależy też od progu. Słaby promotor aktywny tylko po nadekspresji może nie mieć znaczenia przy fizjologicznym stężeniu. „Sigma rozpoznaje 500 promotorów” bez warunku, metody i kryterium nie jest trwałą cechą gatunku.

Rodzina σ⁷⁰ obejmuje kilka konstrukcji domenowych

Czynniki typu σ⁷⁰ grupuje się według zachowanych domen. Grupa 1 obejmuje podstawowe sigma z pełnym zestawem regionów, grupa 2 podobne alternatywne sigma pozbawione części autohamującej, grupa 3 bardziej wyspecjalizowane czynniki, a grupa 4 — ECF — zachowuje głównie domeny sigma 2 i 4.

Podstawowy region sigma 1.1 pomaga zapobiegać wiązaniu wolnego sigma z DNA i zajmuje kanał RNAP przed załadowaniem promotora. Sigma 2 kontaktuje element −10 oraz uczestniczy w topieniu, sigma 3 może rozpoznawać rozszerzone −10 i sięgać ku powstającemu RNA, a sigma 4 rozpoznaje −35 oraz kontaktuje powierzchnię β.

Schemat domen nie przewiduje pełnej swoistości. Struktury holoenzymu Staphylococcus aureus z σᴬ i alternatywnym σᴮ pokazały odmienny sposób rozpoznawania −10 i krótszy optymalny spacer dla σᴮ.saurnap Przeniesienie konsensusu σ⁷⁰ E. coli na każdy czynnik typu σ⁷⁰ może więc pominąć inną geometrię kompleksu.

ECF sigma łączą sygnał pozacytoplazmatyczny z transkrypcją

Czynniki extracytoplasmic function są liczną i zróżnicowaną grupą sigma typu σ⁷⁰. Często sterują odpowiedzią na uszkodzenia osłon, stres oksydacyjny, dostępność metali, transport albo czynniki powierzchniowe. Mają zredukowaną budowę sigma 2–sigma 4 i zwykle rozpoznają wąski zestaw promotorów.

Struktury RNAP Mycobacterium tuberculosis z ECF σᴴ wykazały sposób wiązania rdzenia, rozpoznania DNA i otwarcia promotora różny w szczegółach od podstawowego sigma.ecf „ECF” nie oznacza jednego regulonu stresu osłon; jest klasą ewolucyjną obejmującą wiele par czujnik–program.

W typowym układzie ECF sigma jest związany przez anty-sigma w błonie. Sygnał pozacytoplazmatyczny zmienia anty-sigma bez konieczności przenikania do cytoplazmy: może wywołać kaskadę proteolizy, zmianę redoks albo związanie innego partnera. Uwolniony sigma natychmiast konkuruje o rdzeń RNAP.

Anty-sigma jest hamulcem stechiometrycznym

Anty-sigma wiąże czynnik sigma i zasłania powierzchnie potrzebne do kontaktu z RNAP lub DNA. Anty-anty-sigma może z kolei związać anty-sigma. Fosforylacja, eksport białka, proteoliza lub zmiana konformacji przełączają, który partner jest dostępny.

Przykładem redoks jest RsrA, cynkowe anty-sigma σᴿ u Streptomyces coelicolor. Utlenienie reaktywnych cystein zmienia strukturę i uwalnia sigma, a po powrocie warunków redukujących białko odbudowuje hydrofobowy rdzeń oraz zdolność hamowania.rsra Jest to bezpośredni czujnik chemiczny, a niekoniecznie wzrost transkrypcji genu sigma.

W odpowiedzi osłonowej RpoE E. coli błonowy anty-sigma RseA jest degradowany etapami po wykryciu nieprawidłowych białek w peryplazmie i sygnałów związanych z LPS. Kaskada proteolizy przenosi informację przez błonę bez klasycznej fosforylacji układu dwuskładnikowego.

σ⁵⁴ jest mechanistycznie osobną rodziną

RpoN, czyli σ⁵⁴, nie jest skróconym wariantem σ⁷⁰. Ma odmienną budowę, rozpoznaje zwykle elementy około −24 i −12 oraz tworzy z RNAP stabilny kompleks zamknięty, który sam nie otwiera sprawnie promotora. Do przejścia w stan otwarty potrzebny jest bakteryjny enhancer-binding protein należący do ATPaz AAA+.

Aktywator, na przykład NtrC w regulacji azotowej, wiąże upstream activation sequence, oligomeryzuje i hydrolizuje ATP. Pętla DNA umożliwia kontakt z kompleksem RNAP–σ⁵⁴, nawet gdy miejsce aktywatora leży dalej od promotora. IHF może wygiąć DNA i ułatwić właściwe zderzenie.

Hydroliza ATP przebudowuje blokujący kompleks σ⁵⁴ i pozwala wprowadzić nić matrycową do centrum RNAP. W układzie hrpL Pseudomonas syringae heteroheksamer HrpR–HrpS działa jako wyspecjalizowany aktywator σ⁵⁴, a jego aktywność jest kontrolowana przez HrpV i HrpG.sigma54

Z tego powodu etykieta „aktywator promotora” obejmuje dwa różne mechanizmy. CRP często poprawia rekrutację holoenzymu σ⁷⁰ bez własnego zużycia ATP, natomiast aktywator σ⁵⁴ wykonuje energetyczną przebudowę już związanego, nieaktywnego kompleksu.

Główne alternatywne sigma E. coli są mapą stanów, nie wzorem wszystkich bakterii

Czynnik Gen Główne skojarzenie w E. coli Ważne zastrzeżenie
σ⁷⁰ rpoD wzrost wegetatywny i większość podstawowej transkrypcji działa także na część promotorów stresowych
σ³⁸ / σˢ rpoS faza stacjonarna i stres ogólny poziom zależy od transkrypcji, translacji i proteolizy
σ³² rpoH szok cieplny i proteostaza cytoplazmy aktywność kontrolują chaperony oraz degradacja
σ²⁴ / σᴱ rpoE stres osłon i białka błony zewnętrznej uwalniany z anty-sigma przez proteolizę
σ⁵⁴ / σᴺ rpoN metabolizm azotu i inne wyspecjalizowane programy wymaga ATPazowych aktywatorów
σ²⁸ / σᶠ fliA późne geny wici i chemotaksji wiązany przez FlgM do czasu postępu montażu
FecI fecI pobieranie żelaza przez cytrynian ECF sterowany sygnałem z układu powierzchniowego

Tabela nie jest listą obowiązkową. B. subtilis ma inne nazwy, sigma sporulacyjne i σᴮ stresu ogólnego o własnej regulacji. Promieniowce mogą kodować liczne ECF, bakterie o zredukowanym genomie tylko kilka, a niektóre programy realizują regulatory inne niż sigma.

σ³² mierzy obciążenie fałdowaniem pośrednio

Po wzroście temperatury zwiększa się liczba nieprawidłowo sfałdowanych białek, które zajmują chaperony DnaK/J. Mniej wolnych chaperonów oznacza słabsze hamowanie σ³², a zmiany struktury mRNA rpoH mogą zwiększać translację. Gdy proteostaza zostaje przywrócona, chaperony pomagają wyłączyć sigma i skierować je do degradacji.

Odpowiedź jest ujemnym sprzężeniem: regulon σ³² produkuje chaperony i proteazy, które usuwają przyczynę oraz ograniczają regulator. Nadekspresja rpoH omija część pomiaru i może przeciążyć RNAP, dlatego nie odtwarza fizjologicznego szoku cieplnego.

RpoS rozdziela wzrost i ochronę

σˢ gromadzi się przy wejściu w fazę stacjonarną i w różnych stresach. Jego poziom jest kontrolowany na wielu etapach, między innymi przez sRNA wpływające na translację oraz proteazę ClpXP i adaptor RssB. Antyadaptory stabilizują RpoS w określonych warunkach.

Więcej RpoS zwiększa ochronę, ale konkurencja z RpoD może obniżyć ekspresję pobierania i szybkiego wzrostu. W długotrwałych kulturach mutacje rpoS bywają korzystne w jednych niszach, a kosztowne w stresie. Stan stacjonarny nie jest zatem trwałym „przełączeniem całej RNAP na σˢ”.

FliA łączy montaż struktury z transkrypcją

Anty-sigma FlgM wiąże FliA i hamuje późne geny wici. Po zbudowaniu odpowiedniej części aparatu eksportowego FlgM może zostać wyeksportowane, uwalniając FliA. Program transkrypcyjny uruchamia się wtedy dopiero po osiągnięciu kontrolnego etapu montażu.

To przykład regulacji poza prostym pomiarem stężenia metabolitu. Białko strukturalne pełni rolę sygnału postępu. Szczegółowa budowa wici i chemotaksja należą do odrębnego artykułu.

Kaskady sigma tworzą porządek czasowy

Podczas sporulacji B. subtilis kolejne sigma działają w komórce macierzystej i foresporze w określonej sekwencji. Aktywacja jednego przedziału wysyła sygnał do drugiego, a proteoliza pro-sigma, anty-sigma i czynniki kontrolne wiążą ekspresję z morfogenezą.

Kaskada nie jest zwykłym szeregiem σᴬ → σᴮ. Każdy czynnik ma własny przedział, czas i warunek aktywacji, a błędne uruchomienie poza etapem może być bezproduktywne. Reporter całej populacji miesza komórki macierzyste, forespory i komórki, które nie rozpoczęły sporulacji.

Podobne zasady występują w rozwoju promieniowców, tworzeniu struktur powierzchniowych i cyklach fagowych: następny program zależy od produktu lub stanu osiągniętego przez poprzedni. Sam profil mRNA nie zawsze rozróżnia kaskadę w jednej komórce od mieszaniny subpopulacji.

Regulacja przez sigma współdziała z regulatorami swoistymi

Sigma określa klasę promotorów, ale lokalny aktywator lub represor decyduje, które z nich w danej chwili są produktywne. Promotor rozpoznawany przez RpoS może nadal wymagać OxyR, PhoB albo innego czynnika. Regulon sigma i regulon czynnika transkrypcyjnego przecinają się jak dwie osie logiczne.

Układy dwuskładnikowe często sterują aktywatorem przez fosforylację, a nie wymianę sigma. Kinaza sensoryczna przekazuje fosforan regulatorowi odpowiedzi, który wiąże miejsca promotorowe. W przypadku σ⁵⁴ ufosforylowany aktywator może dodatkowo oligomeryzować jako ATPaza przebudowująca holoenzym.

Nukleoidowe białka H-NS, Lrp, Fis i IHF zmieniają dostępność oraz geometrię większych regionów. H-NS może wyciszać AT-bogaty DNA nabyty poziomo, a aktywator przełamuje wyciszenie. Promotor o dobrych motywach pozostaje wtedy nieaktywny nie dlatego, że sigma go nie rozpoznaje, lecz dlatego, że kontekst jest zamknięty albo nieproduktywny.

Archeony nie używają bakteryjnych czynników sigma

Archeony organizują wiele genów w operony i mogą tworzyć policistronowe RNA, ale ich aparat inicjacji przypomina bardziej eukariotyczny. TBP wiąże TATA-box, TFB rozpoznaje BRE, a wielopodjednostkowa polimeraza ma inną architekturę niż bakteryjny rdzeń z sigma.

Podobna zwartość genomu i brak jądra nie uzasadniają nazywania TFB czynnikiem sigma. Promotory archealne numeruje się względem TSS, lecz ich motywy i etapy montażu trzeba interpretować we własnym systemie.

Operon jest zatem organizacją transkryptu, która nie definiuje typu polimerazy. Występuje u bakterii, archeonów, organelli i sporadycznie w różnych postaciach u eukariontów. Zdanie „operony są wyłącznie bakteryjne” jest zbyt kategoryczne.

Jak znaleźć promotor i TSS

Motyw w genomie jest kandydatem, nie dowodem

Skanowanie konsensusu −35/−10 daje wiele przypadkowych trafień, zwłaszcza przy elastycznych odstępach. Algorytm uczony na E. coli może źle oceniać promotor bakterii o innym składzie GC i sigma. Konserwacja w spokrewnionych genomach oraz właściwa orientacja wzmacniają hipotezę, ale nie dowodzą aktywności.

TSS można wyznaczyć przez primer extension, 5′ RACE oraz metody wzbogacające pierwotne końce 5′ z trifosforanem, takie jak dRNA-seq, Cappable-seq lub Capp-Switch. Przetworzony koniec RNA może leżeć blisko prawdziwego TSS; wykorzystanie chemii końca pomaga je rozróżnić.

Jedna pozycja startu może przesuwać się z warunkami. Capp-Switch u Clostridium phytofermentans ujawnił tysiące TSS i zmiany ich wykorzystania zależne od substratu, a integracja z RNA-seq i proteomiką pozwoliła odnaleźć nowe jednostki.cappswitch Mapa z jednego podłoża nie jest kompletnym repertuarem promotorów gatunku.

Mutageneza promotora testuje konieczność sekwencji

Podstawienia w −10, −35, spacerze, miejscu regulatora i +1 można porównać w reporterze albo w chromosomie. Seria wariantów jest silniejsza niż delecja dużego regionu, która zmienia odstępy i topologię. Wysokoprzepustowe biblioteki promotorów pozwalają mierzyć interakcje między motywami zamiast sumować ich efekty.laclibrary

Wynik reportera zależy od białka, czasu dojrzewania, liczby kopii i stabilności. GFP kumuluje historię ekspresji, lucyferaza wymaga substratu, a β-galaktozydaza daje sygnał enzymatycznie amplifikowany. Reporter transkrypcyjny zawiera promotor i własne RBS; reporter translacyjny obejmuje także naturalny kontekst inicjacji translacji.

Pomiar na plazmidzie warto potwierdzić w pojedynczej kopii i przez RNA. Mutacja motywu może zmienić nie tylko wiązanie regulatora, ale też lokalne superzwinięcie albo nakładający się promotor.

Jak ustalić granice operonu

RT-PCR z primerami w dwóch sąsiednich genach pokazuje, że istnieją cząsteczki obejmujące złącze. Nie dowodzi, że wszystkie transkrypty są wspólne ani że obejmują cały operon. Genomowy DNA zanieczyszczający próbkę daje identyczny produkt, dlatego potrzebne są kontrola bez odwrotnej transkryptazy i primery dla odległych granic.

Krótko-odczytowe RNA-seq pokazuje ciągłość pokrycia i zmiany między warunkami, ale fragmentuje RNA, więc nie fazuje odległego początku z końcem. Nagły spadek pokrycia może oznaczać terminację, cięcie lub różnicę stabilności. Długie odczyty pierwotnych RNA bezpośrednio łączą TSS z dalszymi genami, choć mają własne błędy i preferencję wobec długości.

Operon powinien mieć dowód na wspólny transkrypt, właściwy kierunek i granice. Mały odstęp oraz wspólna funkcja są dobrymi predyktorami, nie potwierdzeniem. Wewnętrzne TSS i TTS należy zachować w adnotacji zamiast wymuszać jeden wariant kanoniczny.

Terminator jest częścią definicji wariantu

Wewnętrzna spinka z ciągiem U może kończyć część transkrypcji niezależnie od Rho; inne końce wymagają Rho i dostępnego rut. Translacja zmienia dostępność RNA dla Rho, więc mutacja w pierwszym cistronie może przesunąć TTS bez zmiany terminatora DNA.

Mapowanie końców 3′, eksperymenty po zaburzeniu Rho i długie RNA rozróżniają część mechanizmów. Sam predyktor spinki nie podaje wydajności terminacji. Read-through może być regulowany i biologicznie ważny, a nie technicznym „przeciekiem”.

Jak przypisać promotor do czynnika sigma

  1. Wyznacz TSS. Motywy liczy się względem rzeczywistego +1, nie początku ORF.
  2. Znajdź zgodną architekturę. Oceń −10, −35 lub −24/−12, odstęp i orientację dla danego sigma.
  3. Zmień poziom sigma fizjologicznie. Delecja, allel warunkowy albo kontrolowana indukcja powinny zmieniać transkrypt.
  4. Uwzględnij efekty pośrednie. Krótki czas odpowiedzi i brak potrzeby syntezy nowego regulatora wspierają bezpośredniość.
  5. Wykaż wiązanie. ChIP-seq, ChIP-exo albo pokrewna metoda lokalizuje RNAP–sigma przy promotorze.
  6. Zmutuj motyw. Utrata odpowiedzi po zmianie kluczowych zasad wspiera funkcję miejsca.
  7. Odtwórz transkrypcję in vitro. Oczyszczony rdzeń, sigma i DNA rozstrzygają, czy zestaw wystarcza.
  8. Przetestuj konkurentów. Inny sigma może inicjować z tego samego TSS.
  9. Sprawdź warunek i szczep. Anty-sigma, proteoliza i regulatory lokalne zmieniają aktywność.
  10. Raportuj stopień pewności. „Promotor zależny od σᴱ” jest mocniejszym wnioskiem niż „motyw podobny do σᴱ”.

ChIP pokazuje zajęcie, niekoniecznie produktywną inicjację. Holoenzym może wiązać promotor i nie przejść do kompleksu otwartego, szczególnie przy σ⁵⁴. Z kolei słabe lub przejściowe wiązanie może dać transkrypt mimo małego sygnału ChIP.

Jak odróżnić bezpośrednią regulację od kaskady

Po zmianie sygnału wykonuje się gęstą serię czasową RNA-seq albo reporterów. Cele pierwszej fali zmieniają się, zanim zdąży powstać duża ilość białka wtórnego regulatora. Zahamowanie translacji może pomóc, ale samo powoduje stres i zmienia stabilność mRNA.

Wiązanie regulatora w pobliżu właściwego TSS, funkcjonalne miejsce i odtworzenie in vitro tworzą łańcuch dowodów bezpośredniości. Sama korelacja ekspresji w setkach próbek może wskazać regulon, lecz wspólny bodziec może równolegle uruchamiać dwa niezależne czynniki.

Epistaza jest użyteczna: jeżeli sigma uruchamia gen aktywatora, a aktywator właściwy operon, delecja aktywatora powinna znieść późny efekt sigma. Nadekspresja aktywatora może ominąć brak pierwszego kroku, ale poziom niefizjologiczny czasem tworzy sztuczne cele.

Najczęstsze błędy interpretacyjne

  1. „Sąsiadujące geny w tym samym kierunku tworzą operon.” To predykcja wymagająca dowodu wspólnego RNA.
  2. „Wszystkie geny operonu mają jednakową ekspresję.” Translacja, cięcie RNA i degradacja rozdzielają ich ilości.
  3. „Promotor to sekwencja −10.” Aktywność wynika z całej architektury i kontekstu.
  4. „Konsensus jest sekwencją idealnego naturalnego promotora.” Jest statystycznym podsumowaniem wielu miejsc.
  5. „TSS jest początkiem genu.” +1 rozpoczyna RNA, a kodon start rozpoczyna translację.
  6. „Operator zawsze leży obok promotora i wiąże represor.” Miejsca regulatorowe mają różne pozycje i mechanizmy.
  7. „Usunięcie represora maksymalnie włącza operon.” Może brakować aktywatora albo właściwego sigma.
  8. „Laktoza bezpośrednio wiąże każdy element operonu lac.” Induktor zmienia LacI, a CRP i transport dostarczają osobnych wejść.
  9. „Sigma odpada dokładnie po dziesięciu nukleotydach.” Część kompleksów zachowuje sigma podczas elongacji.
  10. „Każdy sigma ma rozłączny regulon.” Promotory i cele znacznie się nakładają.
  11. „Alternatywny sigma aktywuje gen sam.” Nadal potrzebuje rdzenia RNAP, promotora i często regulatorów lokalnych.
  12. „σ⁵⁴ działa jak σ⁷⁰ z innym konsensusem.” Wymaga ATPazowej przebudowy zamkniętego kompleksu.
  13. „ECF oznacza jeden czynnik stresu osłon.” To rozległa klasa wyspecjalizowanych sigma.
  14. „Wzrost RNA po nadekspresji dowodzi bezpośredniego promotora.” Efekt może przechodzić przez kaskadę lub konkurencję o RNAP.
  15. „RT-PCR przez złącze definiuje cały operon.” Pokazuje tylko istnienie jednego obejmującego transkryptu.
  16. „Jedna próbka RNA-seq ujawnia pełny transkryptom.” Wykorzystanie promotorów i terminatorów zależy od warunków.
  17. „Reporter plazmidowy mierzy naturalny promotor.” Liczba kopii, topologia i miareczkowanie regulatorów zmieniają wynik.

Jak raportować architekturę i regulację

Należy podać szczep, warunki wzrostu, fazę, temperaturę, pożywkę i dokładny bodziec. Nazwa operonu nie zastępuje współrzędnych TSS, orientacji, listy genów i rozpoznanych wariantów końca. Sekwencje motywów warto pokazać wraz z pozycją względem +1.

Dla regulatora trzeba rozróżnić zmianę ilości białka, stan aktywacji i zajęcie miejsca DNA. Stężenie całkowitego sigma może wzrosnąć bez wzrostu wolnej puli, jeśli anty-sigma nadal je wiąże. ChIP bez pomiaru transkryptu i transkrypt bez dowodu wiązania odpowiadają na różne części pytania.

Reporter powinien mieć opisany replikon, liczbę kopii, miejsce integracji, granice fragmentu promotora, RBS, gen raportera i sposób normalizacji. Warto podać rozkład pojedynczych komórek, nie tylko średnią, jeżeli układ ma dodatnie sprzężenie albo pulsy.

W doświadczeniu z mutantem trzeba kontrolować polarność. Delecja regulatora w operonie może zmniejszyć dalsze geny, a wstawiona kaseta selekcyjna dodać promotor lub terminator. Allel niepolarny i komplementacja w fizjologicznym poziomie są silniejszym dowodem.

Adnotacja regulonu powinna rozdzielać cele bezpośrednie, zależne i przewidywane. Dobrą praktyką jest tabela dowodów: TSS i motyw, wiązanie, odpowiedź mutanta, mutageneza miejsca oraz transkrypcja in vitro.

Granice tego artykułu

Ten tekst skupia się na wyborze jednostek i inicjacji transkrypcji. Mechanizm syntezy RNA, elongacja, pauzowanie, terminacja, sprzężenie z rybosomem i kontrola jakości białek są rozwinięte w następnym artykule „Transkrypcja, translacja i ich sprzężenie u bakterii”.

Atenuacja, ryboprzełączniki, sRNA, Hfq, 6S RNA oraz globalne sieci odpowiedzi dostaną osobne opracowanie. Pojawiają się tutaj tylko wtedy, gdy zmieniają dostępność sigma albo granicę operonu. Szczegółowe programy RpoS i sporulacji są także związane z artykułami o stanie stacjonarnym i endosporach.

Projektowanie sztucznych promotorów, kaset ekspresyjnych i wektorów opisuje serwis Genetyka. Naturalny promotor chromosomalny nie powinien być oceniany wyłącznie jak wymienny element konstrukcji: kontekst topologiczny i sieć regulatorowa są częścią jego działania.

Podsumowanie

Operon jest zbiorem genów współobecnych na co najmniej jednym wariancie pierwotnego transkryptu, promotor regionem kierującym inicjacją, a TSS konkretnym pierwszym nukleotydem RNA. Regulon łączy rozproszone jednostki wspólnym regulatorem, natomiast stymulon wspólnym bodźcem. Te poziomy mogą się nakładać, ale nie są zamienne.

Promotor σ⁷⁰ składa się z architektury −35, −10, odstępu, elementów dodatkowych i początkowo transkrybowanego regionu. Konsensus nie jest obowiązkowym hasłem, a „siła” wynika z kilku etapów kinetycznych. Aktywatory i represory zmieniają rekrutację, otwieranie lub ucieczkę RNAP; operon lac łączy represję LacI, aktywację CRP i sprzężenie przez transport laktozy.

Czynniki sigma kierują wspólny rdzeń RNAP do różnych klas promotorów. Ich regulony konkurują i zachodzą na siebie. Sigma typu σ⁷⁰ obejmują czynnik podstawowy, wyspecjalizowane grupy i ECF, natomiast σ⁵⁴ tworzy osobną rodzinę wymagającą ATPazowego aktywatora. Anty-sigma, proteoliza i kontrola redoks pozwalają przełączać program bez oczekiwania na syntezę nowego aparatu.

Wiarygodna mapa wymaga połączenia TSS, pełnych transkryptów, mutagenezy promotora, reporterów, wiązania RNAP–sigma i zależności genetycznej. Bliskość genów, motyw konsensusowy, pojedynczy RT-PCR lub zmiana RNA po nadekspresji są użytecznymi wskazówkami, lecz każde z osobna pozostaje zbyt słabe do definitywnego przypisania operonu lub regulonu.