Metody pomiaru biomasy

Biomasy nie opisuje jeden uniwersalny miernik. OD odpowiada na rozpraszanie światła, JTK na zdolność utworzenia kolonii, sucha masa na masę pozostałości, cytometr na zdarzenia o zadanych cechach, a qPCR na liczbę cząsteczek docelowego DNA. Wszystkie mogą rosnąć lub maleć inaczej w tej samej próbce.

Porównywarka ocenia metody względem celu i ograniczeń. Wynik jest rankingiem dopasowania, nie walidacją. Najczęściej właściwa odpowiedź to metoda szybka do śledzenia procesu plus niezależna metoda odniesienia, która mierzy bliższą decyzji własność.

Przejdź do kalkulatora

Najpierw zdefiniuj measurand

Measurand to wielkość, którą zamierza się zmierzyć. „Biomasa” jest zbyt szeroka. Może oznaczać suchą masę komórek, liczbę wszystkich komórek, liczbę zdolnych do wzrostu na podłożu, objętość cząstek, aktywność metaboliczną albo ilość DNA danego taksonu.

Wynik ma sens dopiero po pełnej nazwie:

• OD600 zawiesiny w kuwecie 1 cm po korekcie blanku;
• sucha masa zatrzymana na filtrze po określonym suszeniu;
• JTK/mL na danym podłożu i w danych warunkach;
• komórki/mL w bramce cytometrycznej z określonym barwieniem;
• kopie genu/mL po zdefiniowanej ekstrakcji;
• sygnał pojemnościowy skalibrowany do żywej objętości komórkowej.

Bez tej definicji dwie metody mogą wyglądać na sprzeczne, choć mierzą inne frakcje.

Gęstość optyczna: szybki trend, nie liczba komórek

OD jest szybkie, tanie i zwykle nieniszczące dla małej próbki. Dobrze śledzi trend jednorodnej hodowli w zakresie, w którym sygnał jest monotoniczny i skalibrowany. Może być mierzone w kuwecie, mikropłytce lub sondą procesową.

Sygnał zależy od rozpraszania, a więc wielkości, kształtu, współczynnika załamania, agregacji i geometrii instrumentu. Dwie kultury o tej samej suchej masie mogą mieć inne OD. Zmiana z krótkich pałeczek w długie filamenty zmienia relację bez zmiany masy.

Barwne podłoże, pęcherzyki, osad i produkt absorbujący zaburzają wynik. Blank powinien odpowiadać matrycy w danym czasie, co w złożonym procesie nie zawsze jest możliwe.

Najlepsze zastosowanie: gęsta, jednorodna hodowla i szybki trend po lokalnej kalibracji. Najgorsze: bardzo mała liczebność, biofilm, silnie barwna matryca i porównanie różnych morfologii.

Sucha masa: bliżej bilansu, ale wolno i nieselektywnie

Sucha masa komórkowa polega na oddzieleniu biomasy, płukaniu, suszeniu do zdefiniowanego stanu i ważeniu. Wynik w g/L jest użyteczny w bilansach i uzyskach, zwłaszcza dla gęstych hodowli.

Pozostałość może zawierać sole, podłoże, cząstki nośnika i EPS. Niedostateczne płukanie zawyża wynik, zbyt intensywne wypłukuje składniki komórkowe. Suszenie do „stałej masy” wymaga kryterium; gorący filtr waży inaczej przez konwekcję i wilgoć.

Metoda jest destrukcyjna, wymaga stosunkowo dużej ilości materiału i ma słabą czułość przy małej biomasie. Dla grzybów strzępkowych może być bardziej reprezentatywna niż liczba komórek, o ile oddzielenie od nierozpuszczalnego podłoża jest możliwe.

Mokra masa: szybka, lecz zależna od wody między komórkami

Osad po wirowaniu można zważyć, ale zatrzymana ciecz i stopień upakowania silnie zmieniają wynik. Prędkość, czas, rotor, temperatura i dekantacja muszą być stałe. Mokra masa jest użyteczna jako lokalny wskaźnik procesu, rzadko jako przenośny uzysk.

Nie należy przeliczać mokrej masy na suchą jednym uniwersalnym współczynnikiem. Zawartość wody zmienia się ze szczepem, fazą, osmolarnością i EPS.

JTK: wynik funkcjonalny zależny od warunków hodowli

JTK odpowiada na pytanie, ile jednostek w badanej porcji utworzyło widoczną kolonię. Jest ważne, gdy decyzja dotyczy zdolności wzrostu: skuteczności inaktywacji, inokulum, jakości żywności albo odzysku organizmu.

Metoda jest powolna i selektywna. Agregat daje jedną kolonię, a żywa komórka niedostosowana do podłoża nie daje żadnej. Konkurencja i uszkodzenie zmieniają odzysk. Wynik nie obejmuje VBNC ani organizmów wymagających innych warunków.

Najlepsze zastosowanie: operacyjna frakcja hodowlana. Najgorsze: natychmiastowe sterowanie, złożona społeczność bez selekcji i organizmy niehodowalne daną metodą.

Kalkulator JTK z wielu płytek wykonuje rachunek płytek.

Liczenie mikroskopowe: obraz i liczba w polu

Komora zliczeniowa lub analiza obrazu daje liczbę obiektów w znanej objętości albo powierzchni. Umożliwia ocenę morfologii i agregatów. Bez barwienia zwykle nie odróżnia komórek żywych od martwych.

Granice segmentacji decydują, czy pączkująca komórka, filament lub skupisko jest jednym obiektem. Mała liczba pól zwiększa błąd próbkowania, a ruchliwe komórki utrudniają obraz. Autofokus i automatyzacja nie zastępują walidacji bram obiektu.

Metoda jest dobra dla komórek dostatecznie dużych i próbek, w których można uzyskać reprezentatywny preparat. Dla biofilmu obraz 3D może być bardziej informacyjny niż liczba, ale wymaga definicji objętości i segmentacji.

Cytometria przepływowa: rozkład pojedynczych zdarzeń

Cytometr szybko mierzy rozpraszanie i fluorescencję tysięcy zdarzeń. Z barwnikami może rozdzielać frakcje o uszkodzonej błonie, aktywności enzymatycznej lub określonym antygenie. Beads o znanym stężeniu pozwalają uzyskać liczbę objętościową.

„Żywy/martwy” jest interpretacją zestawu barwników, nie bezpośrednią obserwacją przyszłego podziału. Komórka z nieuszkodzoną błoną może nie utworzyć kolonii, a przejściowo przepuszczalna odzyskać funkcję. Agregaty i małe bakterie mogą nakładać się na szum.

Konieczne są kontrole barwienia, kompensacja, beads, ustawienia progów i zapis bramek. Metoda jest szybka i wieloparametrowa, ale droższa oraz bardziej zależna od analizy niż proste OD.

ATP i sygnały metaboliczne: aktywność, nie masa

Bioluminescencyjny test ATP może szybko wykrywać biologiczne pozostałości i trend aktywnej biomasy. ATP na komórkę zmienia się z fizjologią, a próbka może zawierać ATP pozakomórkowe lub pochodzące z innych organizmów.

Redukcja barwnika, zużycie tlenu, produkcja CO2, ciepło i zakwaszenie także są sygnałami aktywności. Przeliczenie na biomasę wymaga stałej relacji, która często zmienia się przy przejściu z wzrostu do maintenance.

Najlepsze zastosowanie: szybkie wykrywanie zmiany lub aktywności. Najgorsze: stechiometryczny bilans biomasy bez równoległej kalibracji.

Białko, DNA i składniki komórkowe

Całkowite białko może przybliżać biomasę po ekstrakcji, ale podłoże i białka wydzielone zaburzają wynik. DNA obejmuje komórki żywe, martwe i materiał pozakomórkowy; liczba kopii genomu na komórkę może zmieniać się z szybkością wzrostu.

Metody te są destrukcyjne i zależne od odzysku ekstrakcji. Są użyteczne, gdy próbka jest trudna do zważenia albo potrzebny jest składnik komórkowy, lecz nie powinny być nazywane bezpośrednim liczeniem komórek.

qPCR i dPCR: swoistość taksonomiczna z ograniczeniami ekstrakcji

qPCR mierzy sygnał amplifikacji docelowej sekwencji, a dPCR liczy dodatnie partycje i estymuje liczbę kopii. Mogą ilościowo śledzić konkretny takson w mieszaninie, czego OD i sucha masa nie potrafią.

Wynik zależy od lizy, odzysku, inhibitorów, liczby kopii genu i DNA martwych komórek. Barwniki wykluczające DNA z uszkodzonych komórek wprowadzają dodatkowe założenia i nie tworzą uniwersalnego testu żywotności.

Najlepsze zastosowanie: cel molekularny w złożonej próbce. Najgorsze: całkowita masa i natychmiastowa ocena zdolności do kolonii.

Pojemność dielektryczna i impedancja

Sondy pojemnościowe wykorzystują polaryzację komórek z nieuszkodzoną błoną w polu zmiennym. Mogą dostarczać sygnał online związany z żywą objętością komórkową w bioreaktorze.

Odpowiedź zależy od wielkości, morfologii, przewodności medium, pęcherzyków i częstotliwości. Zmiana komórek drożdży lub grzybni może zmienić kalibrację. Sonda nie mierzy JTK ani suchej masy bez modelu.

Jej przewagą jest ciągłość i brak pobierania próbek. Najlepiej sprawdza się po kalibracji w konkretnym procesie i równoległej metodzie offline.

Analiza gazów odlotowych jako pośredni sygnał procesu

OUR, CER i RQ opisują pobieranie tlenu oraz wydzielanie CO2. Są bardzo użyteczne online do wykrywania zmian metabolizmu, końca substratu i przejścia faz. Nie są bezpośrednią biomasą.

Przy stałym stanie fizjologicznym szybkość oddychania może korelować z aktywną biomasą. Po zmianie substratu ta sama biomasa ma inne OUR. Bilans wymaga przepływu, wilgotności, ciśnienia i korekty opóźnienia gazu.

Czujniki gazów odlotowych: BlueSens i analiza OUR/CER/RQ rozwija obliczenia.

Fluorescencja reporterowa i autofluorescencja

Reporter może śledzić ekspresję, a nie całkowitą biomasę. Sygnał na komórkę zależy od promotora, dojrzewania fluoroforu, tlenu i degradacji. Całkowita fluorescencja łączy liczbę komórek z ekspresją.

Fluorescencja chlorofilu jest użyteczna dla organizmów fotosyntetycznych, ale zmienia się ze stanem aparatu fotosyntetycznego. W obu przypadkach potrzebna jest kalibracja i blank matrycy.

Biofilm wymaga wielkości przestrzennej

OD supernatantu pomija biomasę przytwierdzoną, a krystaliczny fiolet barwi komórki i macierz bez rozróżnienia żywotności. Sucha masa może obejmować nośnik. JTK po odrywaniu zależy od skuteczności dyspersji.

Metody biofilmu mierzą różne własności:

• barwienie całkowitej przytwierdzonej materii;
• mikroskopia objętości i grubości;
• JTK po odzysku frakcji hodowlanej;
• aktywność metaboliczna;
• skład macierzy;
• sygnał impedancyjny lub masowy na powierzchni.

Co najmniej dwie komplementarne metody są zwykle potrzebne, jeśli wniosek dotyczy struktury i żywotności.

Organizmy strzępkowe i agregujące

Grzybnia nie ma oczywistej „liczby komórek”. Fragmentacja zmienia JTK, OD i liczbę cząstek bez proporcjonalnej zmiany masy. Pellet o tym samym ciężarze co rozproszona grzybnia rozprasza światło inaczej.

Sucha masa, obraz morfologii i reologia mogą być lepszym zestawem niż pojedyncza liczba. W bioprocesie morfologia wpływa na transfer tlenu i lepkość, więc sama biomasa nie wystarcza.

Mieszana społeczność

Sucha masa i OD mierzą sumę bez przypisania do taksonu. JTK na selektywnym podłożu wybiera operacyjną frakcję. qPCR, FISH i cytometria z sondami mogą nadać swoistość, ale każda zależy od celu i odzysku.

Metagenomika dostarcza względnych lub po kalibracji ilościowych informacji o DNA, lecz nie jest prostą wagą biomasy. Spike-in, liczba całkowita i objętość próbki są potrzebne do przejścia od udziału względnego do liczby bezwzględnej.

Bardzo mała liczebność

Przy małej liczbie kluczowe jest zagęszczenie i zbadana objętość. OD oraz sucha masa nie mają czułości. Filtracja z JTK, cytometria dużej objętości albo qPCR mogą być właściwe, lecz mają inne granice.

Zero zdarzeń musi być interpretowane względem objętości. Metoda o doskonałym detektorze nie wykryje organizmu, który nie trafił do porcji.

Pomiar nieniszczący i online

Nieniszczący może znaczyć bez lizy próbki albo bez pobierania jej z reaktora. OD w kuwecie nie niszczy komórek, ale próbka zwykle nie wraca z powodu ryzyka kontaminacji. Sonda OD, pojemność i gaz odlotowy są rzeczywiście online.

Sonda online ma problem osadu, dryfu i reprezentatywności miejsca. Metoda offline ma opóźnienie, ale łatwiej ją powiązać ze wzorcem. Dobra strategia łączy oba kanały.

Kalibracja między metodami

Relacja OD–sucha masa albo pojemność–żywa masa powinna być dopasowana w zakresie procesu. Kalibracja nie jest uniwersalna między instrumentami. Należy zachować surowy sygnał, równanie, zakres, reszty i niepewność.

Przy regresji wymuszenie przejścia przez zero bywa błędne, jeśli blank ma offset. Nieliniowy zakres może wymagać rozcieńczenia lub innego modelu, ale model nie powinien zastępować fizycznie nasyconego sygnału.

Jeśli porównywarka otrzyma odpowiedź „kalibracja niemożliwa”, obniża ranking metod pośrednich. Nie oznacza to, że są bezużyteczne; powinny wtedy pozostać w jednostkach pierwotnych.

Walidacja metody dla decyzji

Metoda śledząca trend może wymagać dobrej precyzji względnej, ale nie dokładności masowej. Metoda zwalniająca partię wymaga kryteriów, kontroli i zakresu. Parametry walidacyjne wynikają z celu.

Trzeba ocenić selektywność, liniowość, precyzję, odzysk, LoD/LoQ, odporność i carry-over odpowiednio do technologii. Walidacja i weryfikacja metody rozdziela te pojęcia.

Macierz szybkiego porównania

Metoda	Wynik pierwotny	Szybkość	Żywe/martwe	Online	Główna pułapka
OD/turbidymetria	rozpraszanie/absorbancja pozorna	sekundy	nie	tak	morfologia i nieliniowość
sucha masa	masa pozostałości	godziny	nie	nie	sole i materiał niekomórkowy
JTK	kolonie w warunkach	dni/godziny	hodowlane	nie	agregaty i selektywny odzysk
mikroskopia	obiekty/objętość	minuty	po barwieniu przybliżone	rzadko	segmentacja i mała liczba pól
cytometria	zdarzenia i fluorescencja	minuty	operacyjne	at-line	bramki, szum, agregaty
ATP	luminescencja aktywności	minuty	aktywność	at-line	ATP na komórkę i tło
qPCR/dPCR	kopie sekwencji	godziny	zwykle nie	nie	ekstrakcja i DNA martwych
pojemność	odpowiedź dielektryczna	sekundy	błona/objętość	tak	morfologia i przewodność
gaz odlotowy	OUR/CER	sekundy-minuty	aktywna funkcja	tak	metabolizm zmienia się na komórkę

Najczęstsze błędy porównawcze

Najczęstszy błąd to regresja jednej metody na drugą i nazwanie obu równoważnymi. Dobra korelacja w jednym zakresie nie dowodzi wspólnego measurandu. OD może korelować z JTK w fazie wykładniczej, a rozdzielić się podczas śmierci.

Inne błędy to:

• porównanie surowego OD z suchą masą bez blanku;
• użycie JTK jako wszystkich żywych komórek;
• nazwanie dodatniej fluorescencji dowodem zdolności podziału;
• raportowanie kopii genu jako komórek bez liczby kopii;
• liczenie agregatu jako jednej komórki bez definicji;
• użycie całkowitego białka w podłożu bogatym;
• przeniesienie kalibracji między organizmami;
• pominięcie objętości i granicy wykrycia.

Strategia dwóch metod

Do rutynowego procesu warto dobrać szybki wskaźnik i okresową metodę odniesienia. Przykłady:

• OD online + sucha masa dla uzysku;
• pojemność + JTK przy pytaniu o frakcję hodowlaną;
• gaz odlotowy + HPLC substratu i produktu;
• cytometria żywotności + JTK;
• qPCR celu + całkowita liczba komórek lub spike-in;
• obraz biofilmu + odzysk JTK.

Rozbieżność jest informacją o fizjologii lub błędzie, nie powodem automatycznego wyboru „ładniejszej” liczby.

Jak raportować wybór

Raport powinien podać pytanie, measurand, metodę pierwotną, kalibrację, zakres, matrycę, próbkę, obróbkę, kontrolę i ograniczenia. Przykład:

OD600 służyło do ciągłego śledzenia trendu w zakresie 0,05–0,8 po rozcieńczeniu. Dla każdej partii przeliczano OD na suchą masę lokalnym modelem z trzema punktami odniesienia. JTK oznaczano osobno jako frakcję hodowlaną; nie przeliczano go na całkowitą liczbę komórek. Zmianę morfologii kontrolowano obrazem.

Powiązane artykuły

OD, JTK, liczba komórek i sucha masa — różne miary biomasy rozwija podstawy. Powtórzenie techniczne a biologiczne dotyczy planu próbkowania, a Dokładność, precyzja, odzysk, liniowość, LoD i LoQ parametrów metody.

Źródła i dalsza lektura

Porównanie opracowano z rozdziałów o wzroście i pomiarze w książkach Mikrobiologia, Mikrobiologia — krótkie wykłady, Mikrobiologia ogólna i przemysłowa — ćwiczenia laboratoryjne oraz Pomiary, czujniki i metody pomiarowe, zakupionych z licencją do wykorzystania wiedzy. Terminologię metod skonfrontowano z otwartymi materiałami NCBI i NIST.^{ncbi-biomass,nist-measurement}