Plazmid jest replikonem zdolnym do utrzymywania się niezależnie od głównego chromosomu komórki, najczęściej jako kowalencyjnie zamknięta kolista cząsteczka dwuniciowego DNA. „Niezależnie” nie oznacza samowystarczalnie: plazmid koduje własny punkt inicjacji i część regulatorów, lecz korzysta z polimeraz, nukleotydów, rybosomów, błon i energii gospodarza. Jego los zależy jednocześnie od replikacji, segregacji, transferu, selekcji i kosztu dla komórki.baj

Naturalny plazmid nie jest wyłącznie laboratoryjnym wektorem ani pojemnikiem na gen oporności. Jest ewoluującą jednostką z własnym kręgosłupem utrzymania, zmiennym ładunkiem i historią rekombinacji. Może być mały i wysokokopijny, wielusetkilobazowy i obecny w jednej kopii, koniugacyjny, tylko mobilizowalny albo całkowicie niemobilny. Ta różnorodność uniemożliwia jedną definicję opartą na rozmiarze, kształcie czy fenotypie.

Co odróżnia plazmid od innych replikonów

Obiekt Własna inicjacja replikacji Zwykły sposób utrzymania Typowa relacja z komórką
główny chromosom tak obowiązkowa replikacja i segregacja niesie większość funkcji podstawowych
plazmid tak autonomiczna kontrola kopii, często partycja zwykle warunkowo korzystny lub pasożytniczy
chromid tak, plazmidopodobny stabilny wtórny replikon niesie geny podstawowe i ma skład podobny do chromosomu
wyspa genomowa nie po integracji replikuje się z chromosomem zmienny region, czasem zdolny do wycięcia
transpozon nie jako samodzielny replikon przemieszcza się w innym DNA moduł transpozycji i ładunku
profag replikuje się z chromosomem albo w cyklu faga integracja lub produkcja cząstek genom wirusa w komórce

Granice bywają płynne. Plazmid może integrować się z chromosomem jako episom, utworzyć cointegrat z innym plazmidem lub nabyć tyle funkcji podstawowych, że staje się chromidem. ICE jest zintegrowany i replikuje się z chromosomem, ale po wycięciu może przejściowo tworzyć kolistą formę; sama obserwacja koła nie czyni go plazmidem.

Historyczne słowo „episom” oznaczało element mogący występować autonomicznie albo w integracji. Nie jest synonimem każdego plazmidu. F plazmid może integrować się w chromosom Escherichia coli, lecz wiele plazmidów nie ma takiego typowego etapu.

Plazmid jest zbiorem modułów

Kręgosłup obejmuje funkcje potrzebne do powielania i trwałego dziedziczenia. Ładunek nadaje cechy zależne od środowiska. Między nimi leżą elementy rekombinacyjne, które przemieszczają moduły i tworzą mozaikę.

Moduł Przykładowe składniki Pytanie funkcjonalne
replikacja oriV, Rep, RNA starterowy, iterony czy i jak cząsteczka kopiuje się w gospodarzu
kontrola kopii antysensowny RNA, represor, autoregulacja Rep ile inicjacji zachodzi na cykl wzrostu
partycja ParA/ParB/parS, ParM/ParR/parC czy nieliczne kopie trafiają do obu córek
rozdzielanie multimerów miejsca cer, res, rekombinazy gospodarza/plazmidu czy fizyczne kopie pozostają jednostkami segregacji
stabilizacja toksyna–antytoksyna, systemy ograniczające koszt co dzieje się po utracie lub zaburzeniu plazmidu
mobilizacja oriT, relaksaza, białka pomocnicze czy DNA może zostać przygotowane do transferu
koniugacja mating-pair formation/T4SS, pilus lub aparat kontaktu czy plazmid koduje kanał transferowy
ładunek oporność, metabolizm, wirulencja, symbioza, bakteriocyny kiedy nosiciel zyskuje przewagę

Nie ma jednego obowiązkowego zestawu. Mały plazmid może używać wyłącznie hostowych białek replikacyjnych i nie mieć partycji, bo wiele kopii zapewnia losowy rozdział. Duży niskokopijny replikon koduje Rep, partycję i regulację transferu. Mobilizowalny plazmid ma oriT oraz relaksazę, ale korzysta z aparatu koniugacyjnego innego elementu.

Modułowość sprzyja wymianie. Transpozon z genem oporności może wejść do kilku niespokrewnionych plazmidów; ten sam plazmid może zmienić wariant kapsuły lub system obrony. Dlatego śledzenie pojedynczego genu nie jest śledzeniem plazmidu.

Kształt i rozmiar nie definiują funkcji

Większość znanych plazmidów jest kolista i dwuniciowa, ale istnieją plazmidy liniowe. Jedne mają białka przyłączone do końców 5′, inne kowalencyjnie zamknięte spinki. Liniowe replikony występują między innymi u Streptomyces, Borrelia i pokrewnych bakterii.baj

Małe plazmidy mogą liczyć kilka kilobaz i kodować niewiele poza replikacją oraz jednym fenotypem. Megaplazmidy mają setki kilobaz, rozbudowane systemy partycji, transferu i metabolizmu. Granica „megaplazmidu” jest umowna; duży rozmiar nie czyni cząsteczki chromosomem.

Chromid łączy plazmidopodobny system replikacji z chromosomalnym charakterem: jest stabilny, ma skład oligonukleotydowy zbliżony do głównego chromosomu i niesie geny podstawowe dla linii. Klasyfikacja wymaga relacji ewolucyjnej, nie tylko długości.

Zamknięte koło w złożeniu nie jest pełnym dowodem biologicznym

Assembler oznacza kontig jako circular, gdy jego końce zachodzą na siebie. Może to potwierdzać kolisty replikon, ale powtórzenie, concatemer albo błędna ścieżka grafu również daje pozorne zamknięcie. Potrzebne są odczyty przechodzące przez złącze, równomierne pokrycie i zgodny kontekst.

Z drugiej strony liniowy kontig nie dowodzi liniowego plazmidu. Cząsteczka kolista może nie zostać domknięta z powodu powtórzeń, IS albo brakującego odczytu. „Complete plasmid” powinien oznaczać zweryfikowaną strukturę, nie każdy kontig z genem Rep.

Replikacja theta przypomina lokalny chromosom

W mechanizmie theta inicjacja otwiera oriV, a widełki replikacyjne przemieszczają się jedno- lub dwukierunkowo, tworząc pośrednią strukturę przypominającą grecką literę θ. Plazmid może kodować białko Rep rozpoznające iterony, a do elongacji rekrutować helikazę, primazę i polimerazy gospodarza.

Iterony są bezpośrednimi powtórzeniami przy oriV. Rep wiąże je i pomaga stopić DNA. To samo białko może autoregulować swój promotor. Gdy kopii jest dużo, związane Rep może łączyć dwa originy — „kajdankowanie” — i utrudniać kolejną inicjację. Miareczkowanie Rep przez liczne iterony oraz jego inaktywacja po inicjacji także tworzą ujemne sprzężenie.

Replikony F, P1, RK2/RP4 i część dużych plazmidów używają wariantów theta, lecz różnią się białkami, wymaganiami gospodarza i kontrolą. Nie należy przenosić mapy jednego oriV na całą grupę Inc.

ColE1 kontroluje primer za pomocą antysensownego RNA

W plazmidach typu ColE1 długi transkrypt RNA II hybrydyzuje z matrycowym DNA w pobliżu originu. RNaza H nacina RNA w hybrydzie, tworząc koniec 3′OH używany przez polimerazę DNA I do rozpoczęcia syntezy. Inicjacja nie wymaga plazmidowego białka Rep.

Krótki RNA I jest transkrybowany antysensownie do początkowej części RNA II. Pętle obu RNA najpierw tworzą kissing complex, a rozszerzenie parowania przeorganizowuje RNA II tak, że nie może utworzyć właściwego startera. Rop/Rom stabilizuje interakcję i wzmacnia hamowanie. Więcej kopii produkuje więcej RNA I, więc prawdopodobieństwo następnej inicjacji maleje.baj,cole1

Kontrola jest kinetyczna, nie licznikiem ustawionym na jedną wartość. Szybkość transkrypcji, składanie RNA, degradacja RNA I, RNaza H i fizjologia gospodarza zmieniają rozkład kopii. Mutacja originu w laboratoryjnych pochodnych może podnieść kopię, ale także zwiększyć koszt i niestabilność.

RNA I działa w trans, a RNA II musi powstać przy własnym originie. Dwa plazmidy z podobnymi RNA I/RNA II mogą wzajemnie zaburzać kontrolę, co łączy mechanizm replikacji z niezgodnością.

Rolling-circle replication wytwarza wypartą nić

W replikacji toczącego się koła białko Rep nacina jedną nić w double-strand origin, pozostawiając koniec 3′OH. Polimeraza wydłuża go, wypierając starą nić. Po okrążeniu Rep przeprowadza reakcje kończące i zamykające nową cząsteczkę; wyparta jednoniciowa kopia zostaje dopełniona z single-strand origin.

Mechanizm jest częsty w małych plazmidach bakterii Gram-dodatnich, ale występuje szerzej. Pośredni ssDNA jest podatny na nukleazy i może zwiększać rekombinację. Niesprawny sso w obcym gospodarzu ogranicza zakres replikacji mimo prawidłowego pierwszego etapu.

RCR jest mechanizmem replikacji, nie dowodem mobilności. Relaksaza koniugacyjna również nacina DNA i uruchamia syntezę wypierającą, lecz robi to przy oriT dla transferu. Rep i relaxase mogą być ewolucyjnie spokrewnione w części rodzin, ale pełnią inne role.

Strand displacement i inne mechanizmy poszerzają repertuar

W replikacji z wypieraniem nici synteza może rozpoczynać się w dwóch originach na przeciwnych niciach, a powstające nici wypierają rodzicielskie. Modelowym szerokozakresowym plazmidem wykorzystującym taki układ jest RSF1010. Plazmid koduje więcej własnych funkcji inicjacyjnych, co zmniejsza zależność od specyficznych białek gospodarza.

Nie istnieje prosta zależność „mechanizm = zakres gospodarzy”. Zakres wynika z kompatybilności Rep–ori, dostępności czynników hosta, dojrzewania starterów, topologii, kontroli kopii i kosztu. Mobilność wnosi osobny zestaw barier.

Liczba kopii jest rozkładem, nie etykietą

Copy number może oznaczać kopie na komórkę, chromosom albo ekwiwalent chromosomu. Te mianowniki różnią się podczas szybkiego wzrostu, gdy chromosom ma wiele widełek replikacyjnych. Populacyjna średnia nie pokazuje komórek bez plazmidu ani szerokości rozkładu.

Niskokopijne plazmidy mają zwykle około jednej–kilku kopii na chromosom i potrzebują aktywnej partycji. Wysokokopijne mogą mieć dziesiątki lub więcej, co zmniejsza prawdopodobieństwo losowej utraty, ale zwiększa koszt DNA i ekspresji. Granice „low/medium/high” są konwencjonalne.

Analiza ponad sześciu tysięcy domkniętych plazmidów na podstawie względnego pokrycia wykazała szeroki, bimodalny rozkład copy number i kompromis między rozmiarem a liczbą kopii.copynumber Jest to trend populacyjny, nie reguła pozwalająca przewidzieć konkretną cząsteczkę z długości.

Jak mierzyć copy number

W WGS przybliżeniem jest stosunek mediany pokrycia plazmidu do chromosomu. Wymaga on tej samej wydajności ekstrakcji i biblioteki, jednoznacznego mapowania oraz właściwego punktu odniesienia. Powtórzenia wspólne z chromosomem lub innymi plazmidami zawyżają głębokość.

Chromosom aktywnie rosnącej populacji ma gradient oriC–ter, więc wybór jednego genu referencyjnego może zmienić wynik. Plazmid również replikuje się w trakcie ekstrakcji. Warto raportować kopie na ekwiwalent chromosomu i fazę wzrostu.

qPCR lub ddPCR porównuje locus plazmidowe z jedną albo kilkoma loci chromosomalnymi. Różna wydajność starterów, multimer, niezależna ekstrakcja małych kół i komórki bez plazmidu wpływają na wynik. Mikroskopia z systemem operator–represor może pokazać foci w pojedynczych komórkach, lecz jedno focus może zawierać klaster kopii.

Losowa segregacja wystarcza tylko przy wielu kopiach

Jeśli każda kopia trafia niezależnie do córki, prawdopodobieństwo braku szybko maleje z liczbą kopii. Rozkład nie jest jednak idealnie losowy: kopie mogą tworzyć multimery albo klastry i zachowywać się jak mniejsza liczba jednostek.

Duży wysokokopijny plazmid nadal może być niestabilny, jeśli replikacja jest skupiona przestrzennie. Niskokopijny plazmid bez aktywnej partycji ma wysokie ryzyko utraty. Stabilność trzeba mierzyć przez wiele pokoleń bez selekcji, nie wyprowadzać wyłącznie z copy number.

ParABS ustawia kopie na nukleoidzie

System ParABS składa się z ATPazy ParA, białka ParB i centromeropodobnego miejsca parS. ParB wiąże parS, rozprzestrzenia się lub tworzy skondensowany kompleks wokół miejsca, a ParA wiąże ATP i nukleoid. Oddziaływanie kompleksu ParB–plazmid z dynamiczną pulą ParA prowadzi do przemieszczenia i regularnego pozycjonowania kopii.

Nie jest to miniaturowe wrzeciono ciągnące po stałym włóknie. Plazmid wpływa na lokalną hydrolizę ATP przez ParA i sam kształtuje gradient lub falę, po której się przemieszcza. Ilościowe obrazowanie plazmidu F pokazało szybkie rozdzielanie nowo zreplikowanych foci i pozycje zależne od liczby kopii oraz długości komórki.parabs

parS jest miejscem DNA, nie białkiem. ParB tworzy kompleks cargo, a ParA dostarcza aktywność motoryczną i mapę nukleoidu. Zwiększenie liczby samych miejsc parS może zakłócić system przez miareczkowanie ParB i wywołać niezgodność partycyjną.

ParMRC i TubZ używają innych polimerów

W ParMRC białko ParR wiąże centromeropodobne parC, a aktynopodobny ParM polimeryzuje między kompleksami dwóch kopii i odsuwa je ku przeciwległym obszarom komórki. Dynamiczna niestabilność włókna przypomina niektóre cechy aktyny, ale mechanizm nie jest homologiczny funkcjonalnie do eukariotycznego wrzeciona w każdym szczególe.

Systemy typu TubZ wykorzystują tubulinopodobną GTPazę i adaptor wiążący DNA. Klasy partycji I, II i III grupuje się między innymi według ATPazy Walker, aktynopodobnej ATPazy albo tubulinopodobnej GTPazy. Plazmid może kodować więcej niż jeden system.

Multimery zmniejszają efektywną liczbę jednostek

Rekombinacja homologiczna między identycznymi kolistymi kopiami tworzy dimery i wyższe multimery. Dwie kopie połączone w jedno koło są jedną jednostką segregacji. Przy wysokiej rekombinacji multimery mogą przejmować populację cząsteczek, mimo że całkowita masa DNA wydaje się prawidłowa.

Miejsca takie jak cer ColE1 lub psi pSC101 rekrutują rekombinazy XerC/XerD gospodarza oraz białka pomocnicze i kierują rozdzielanie dimerów do monomerów. Topologia kompleksu zapewnia kierunek reakcji. Inne plazmidy kodują własne resolwazy i miejsca res.multimer

Ten mechanizm nie jest naprawą uszkodzonego plazmidu. Jest kontrolą liczby fizycznych jednostek zdolnych do dziedziczenia. Brak resolution może zwiększyć utratę bez zmiany inicjacji replikacji.

System toksyna–antytoksyna stabilizuje populację po utracie

Klasyczny model zakłada, że plazmid produkuje stabilniejszą toksynę i krótkotrwałą antytoksynę. W komórce z plazmidem antytoksyna neutralizuje toksynę. Po segregacyjnej utracie nie powstają nowe cząsteczki, antytoksyna zanika szybciej, a uwolniona toksyna hamuje wzrost lub zabija segreganta.

Typ II używa białkowej toksyny i białkowej antytoksyny, typ I toksycznego białka oraz antysensownego RNA blokującego jego syntezę, a dalsze typy wykorzystują RNA, enzymatyczną modyfikację lub inne pary. ccdAB F i hok/sok R1 są modelami, ale nie reprezentują każdego TA.

Określenie post-segregational killing bywa zbyt kategoryczne. Część toksyn wywołuje odwracalne zahamowanie wzrostu albo długi filament, a test nadekspresji nie odtwarza fizjologicznej ilości po utracie. Jednokomórkowe śledzenie ccdAB wykazało uszkodzenie DNA, odpowiedź SOS i brak dalszych podziałów u segregantów, dostarczając bezpośredniego dowodu „uzależnienia”, ale mechanizm i końcowy los zależą od pary.ta

TA nie zapobiega utracie DNA w podziale. Zmniejsza sukces linii, która plazmid utraciła, więc zwiększa częstość plazmidu w populacji. Jest to różnica między segregational stability a population-level persistence.

Niezgodność ujawnia wspólny system kontroli

Dwa plazmidy są niezgodne, jeśli nie mogą być stabilnie utrzymywane w tej samej linii bez selekcji. Najczęściej ich systemy kontroli kopii lub partycji nie rozróżniają cząsteczek. Komórka reguluje łączną pulę originów, a losowa segregacja z czasem tworzy córki zawierające tylko jeden typ.

W ColE1 podobne RNA I mogą hamować RNA II obu plazmidów. Układ utrzymuje właściwą sumę kopii, nie osobną liczbę każdego wariantu. Dryf prowadzi do eliminacji jednego replikonu. W systemie partycji wspólne Par może traktować heterologiczne kopie jak jedną pulę cargo.

Grupa Inc jest historycznie fenotypową grupą niezgodności, a nie pełną taksonomią plazmidów. Replicon typing wykrywa charakterystyczne sekwencje replikacji; plazmid wieloreplikonowy może mieć kilka typów. Dwa plazmidy o innym repliconie nadal mogą kolidować przez partycję lub koszt, a blisko spokrewnione mogą współistnieć po zmianie swoistości kontroli.

Test zgodności wymaga wielopokoleniowej hodowli bez selekcji i rozróżnienia obu cząsteczek. Krótkie współwystępowanie po transformacji nie dowodzi kompatybilności.

Mobilność ma co najmniej trzy klasy

Plazmid koniugacyjny koduje relaksazę, oriT, białka sprzęgające i aparat mating-pair formation, zwykle system sekrecji typu IV. Relaksaza nacina oriT, pozostaje związana z końcem transferowanej nici, a kompleks przechodzi przez kanał do biorcy. W obu komórkach synteza DNA uzupełnia brakujące nici.

Plazmid mobilizowalny ma oriT i zwykle własną relaksazę, lecz nie pełny aparat kontaktowy. Może zostać przeniesiony, gdy w tej samej komórce działa zgodny plazmid pomocniczy lub ICE. Mobilizable-in-trans nie oznacza samotransmisyjny.

Plazmid niemobilizowalny nie ma rozpoznawalnego systemu mobilizacji. Nadal może zmienić gospodarza przez transformację, transdukcję, cointegrację lub pakowanie przez inny element. „Non-mobilizable” jest opisem znanego aparatu, nie absolutną niemożliwością HGT.

Transfer i utrzymanie to osobne filtry

Transfer host range obejmuje komórki, do których aparat może dostarczyć DNA. Replication host range obejmuje komórki, w których oriV i Rep działają. Maintenance host range dodatkowo wymaga właściwej kontroli, partycji, braku silnych barier i akceptowalnego kosztu.

Plazmid może wejść do odległego gatunku i zostać szybko utracony, jeśli nie replikuje się. Może też nie przenosić się własnym aparatem, ale stabilnie replikować po sztucznym wprowadzeniu. Eksperymentalna analiza pSN1216-29 pokazała potrzebę oddzielnego pomiaru zakresu transferu i replikacji zamiast wnioskowania obu ze składu oligonukleotydowego.hostrange

Broad-host-range nie oznacza wszystkich bakterii. Barierami są receptor i kontakt, restrykcja–modyfikacja, CRISPR, nukleazy, brak czynników replikacji, niewłaściwa partycja, wyciszenie genów oraz koszt. Zakres ekologiczny jest zwykle węższy od maksymalnego zakresu uzyskanego w laboratorium, bo komórki muszą się spotkać.

Klasyfikacja plazmidów wymaga kilku osi

Nazwy nadawane według fenotypu — R plasmid, virulence plasmid, degradative plasmid, symbiotic plasmid — opisują ładunek, nie pochodzenie. Jeden plazmid może należeć do kilku klas, a utrata transpozonu zmieni fenotyp bez zmiany kręgosłupa.

Replicon typing grupuje systemy replikacji i jest szczególnie rozwinięty dla Enterobacterales. MOB typing używa konserwowanej części relaksazy, a MPF typing aparatu koniugacyjnego. Nie obejmują one odpowiednio plazmidów bez znanego Rep, bez relaksazy lub bez własnego MPF.

Analiza ponad 10 000 plazmidów wykazała klastry całogenomowego podobieństwa nazwane plasmid taxonomic units, PTU. Zidentyfikowano setki jednostek o charakterystycznym zakresie gospodarzy; ponad 60% sklasyfikowanych plazmidów należało do grup przekraczających granicę jednego gatunku gospodarza.ptu PTU jest narzędziem porównawczym zależnym od bazy i progów, nie formalnym gatunkiem według kodeksu nomenklatury.

Sieci podobieństwa uwidaczniają mozaikowość lepiej niż pojedyncze drzewo. Węzły plazmidów łączą się przez współdzielone k-mery lub geny, a moduły sieci odpowiadają części znanych grup. MOB typing jest informacyjny dla transferu, ale nie klasyfikuje plazmidów bez relaksazy.network

Jedno drzewo plazmidów często nie istnieje

Kręgosłup replikacyjny, relaksaza i ładunek mogą mieć różne historie. Rekombinacja tworzy cointegraty, a transpozony wstawiają te same geny do wielu nośników. Drzewo Rep nie jest drzewem całej cząsteczki.

Dla blisko spokrewnionej rodziny można budować filogenezę konserwowanego backbone. Dla globalnego plasmidome lepsze są sieci, PTU i porównanie modułów. Trzeba jawnie powiedzieć, jaka sekwencja była podstawą drzewa.

Ładunek plazmidowy jest warunkowo korzystny

Plazmidy przenoszą geny oporności na antybiotyki i metale, determinanty wirulencji, systemy sekrecji, toksyny, bakteriocyny, szlaki kataboliczne, symbiozę i wiązanie azotu. Korzyść pojawia się tylko w odpowiednim środowisku i tle gospodarza.

Operon mer pozwala przekształcać toksyczne związki rtęci, czc usuwa kobalt/cynk/kadm, a plazmidy degradacyjne umożliwiają wykorzystanie związków niedostępnych dla innych komórek. Plazmid symbiotyczny może kodować nodulację oraz część funkcji wiązania azotu. Cechy te nie są obowiązkowe dla plazmidów jako klasy.baj

Współlokalizacja kilku determinant powoduje co-selection. Metal, biocyd lub jeden antybiotyk może utrzymywać plazmid niosący inne geny oporności. Nie dowodzi to, że każda substancja bezpośrednio indukuje każdy gen; selekcjonowana jest wspólna cząsteczka.

„Virulence plasmid” nie jest samodzielnym patogenem. Fenotyp zależy od chromosomalnych regulatorów, receptorów gospodarza i warunków ekspresji. Przeniesienie plazmidu do innego szczepu może nie odtworzyć wirulencji albo zmienić jej koszt.

Utrzymanie plazmidu jest bilansem pięciu procesów

Częstość plazmidu w populacji zależy od:

  1. segregacyjnej utraty w podziale;
  2. różnicy tempa wzrostu komórek z plazmidem i bez niego;
  3. transferu poziomego do nowych biorców;
  4. selekcyjnej korzyści ładunku w danym środowisku;
  5. ewolucji gospodarza i plazmidu.

Niska utrata nie gwarantuje przetrwania, jeśli koszt jest wysoki. Wysoka utrata może zostać skompensowana częstym transferem. Przy antybiotyku ładunek daje silną korzyść; po usunięciu leku plazmid nie musi zniknąć, jeżeli koszt jest mały, działają inne selektory lub zaszła kompensacja.

W warunkach przestrzennie ustrukturyzowanych donorzy, biorcy i transkoniuganty spotykają się inaczej niż w płynnej, dobrze wymieszanej hodowli. Biofilm może zwiększać kontakty, ale ograniczać dyfuzję i tworzyć gradienty. Parametr „conjugation rate” zależy od modelu i projektu pomiaru.

Koszt nie jest ceną samego DNA

Replikacja dodatkowych zasad zużywa zasoby, lecz często większy koszt wynika z ekspresji białek transferowych, konfliktów regulatorowych, toksyczności produktu, zaburzenia błon lub interakcji replisomów. Ten sam plazmid może być kosztowny w jednym gospodarzu i neutralny w innym.

Copy number, faza wzrostu, podłoże i ładunek zmieniają koszt. Mutacja wyłączająca aparat koniugacyjny może zwiększyć pionową sprawność kosztem transmisji. Repressor transferu jest zatem adaptacją regulującą kompromis między zakaźnością a obciążeniem.

Koszt mierzy się konkurencją izogenicznych szczepów z plazmidem i bez niego, nie tylko osobnymi krzywymi OD. Trzeba potwierdzić, że „bez plazmidu” nie ma mutacji po curing i że marker nie zmienia fitness. Korzyść może być zależna od częstości albo społeczna.

Kompensacyjna ewolucja rozwiązuje „paradoks plazmidu”

Mutacje na plazmidzie lub chromosomie mogą zmniejszyć konflikt, ekspresję, copy number lub koszt aparatu transferu. Selekcja nie musi usuwać plazmidu, jeśli szybciej pojawi się korzystna kompensacja.

W eksperymencie z RP4 u Pseudomonas koszt w ciągu mniej niż 600 pokoleń zmienił się w korzyść. Mutacje chromosomalne dotyczyły między innymi helikaz pomocniczych i podjednostki β RNAP, a wyewoluowane gospodarze lepiej tolerowały również naiwne plazmidy.compensation Pokazuje to ewolucję permissiveness, nie uniwersalny zestaw genów kompensacyjnych.

Kompensacja może utrwalić oporność po ustaniu selekcji antybiotykiem. Usunięcie leku nie odwraca automatycznie historii. Plazmid może też stracić kosztowny fragment, zintegrować ładunek z chromosomem albo utworzyć korzystną epistazę z innym plazmidem.

Plazmidy konkurują, współpracują i tworzą cointegraty

W jednej komórce mogą występować zgodne plazmidy. Dzielą zasoby i aparaty, konkurują o białka gospodarza, a mobilizowalny element korzysta z MPF pomocnika. Jeden plazmid może kodować entry exclusion ograniczające ponowne wejście pokrewnego elementu.

Rekombinacja homologiczna lub transpozycja może połączyć dwa plazmidy w cointegrat. Taka cząsteczka ma kilka repliconów i modułów transferowych. Późniejsze rozdzielenie nie musi odtworzyć rodziców, więc ładunki przemieszczają się między backbone.

Kilka repliconów w jednej sekwencji nie dowodzi, że wszystkie są aktywne. Jeden może być reliktem po cointegracji. Funkcję sprawdza się przez inicjację, delecję i host range, nie sam hit w bazie.

Jak wykrywać plazmidy w danych genomowych

Krótkie odczyty często rozrywają najważniejsze miejsca

IS, transpozony i wspólne geny oporności występują na plazmidach i chromosomie. Krótki odczyt nie łączy unikalnego cargo z backbone przez długie powtórzenie. Assembly graph pozostawia wiele ścieżek i kontigów o niepewnym pochodzeniu.

Klasyfikatory wykorzystują copy number, GC, k-mery, geny Rep/MOB i podobieństwo do baz. Każda cecha ma wyjątki: duży niskokopijny plazmid ma pokrycie chromosomalne, stary plazmid ma skład gospodarza, a nowy backbone może nie mieć odpowiednika w bazie.

MOB-suite rekonstruuje i typuje plazmidy z draft assemblies, łącząc bazy repliconów, relaxaz i klastrów; w walidacji zamkniętych genomów osiągał wysoką czułość, ale nie rozwiązuje dowolnego powtórzenia.mobsuite Wynik predykcyjny powinien zachować stopień pewności.

Długie i hybrydowe odczyty łączą moduły

Długie odczyty mogą przejść przez IS i wykazać, czy gen leży na plazmidzie czy chromosomie. Dokładne krótkie odczyty poprawiają błędy bazowe, więc hybrydowe składanie często domyka więcej replikonów i lepiej przypisuje geny oporności niż same krótkie odczyty.hybrid

Trudności pozostają przy izomerach, powtórzonych plazmidach, małych kołach traconych podczas ekstrakcji i mieszaninie wariantów. Należy oglądać graf, pokrycie oraz odczyty wspierające każde złącze. Automatyczne „circularized” nie kończy walidacji.

Metagenom nie przypisuje łatwo plazmidu do gospodarza

Plazmid wyizolowany z całej społeczności może nie mieć jednoznacznego hosta. Skład k-merów i współzmienność obfitości dają predykcję, lecz szerokozakresowy plazmid może mieć wielu gospodarzy. Hi-C, single-cell, epicPCR i izolacja transkoniugantów dostarczają innych rodzajów powiązania, każdy z artefaktami.

„Plazmid znaleziony w glebie” opisuje próbkę, nie gatunek gospodarza. Host range obserwowany w bazach łączy biologię i bias izolacji — plazmidy patogenów klinicznych są nadreprezentowane.

Jak potwierdzić naturalny plazmid eksperymentalnie

Izolacja frakcji plazmidowej i elektroforeza pokazują pozachromosomowe formy, ale ekstrakcja preferuje małe superzwinięte koła. Duże i liniowe plazmidy mogą zniknąć. PFGE z odpowiednią obróbką ujawnia duże replikony, lecz nie przypisuje automatycznie sekwencji.

Southern blot lub mapowanie długich odczytów może powiązać gen z pasmem/replikonem. Egzonukleaza trawiąca liniowe DNA wzbogaca koła, ale również eliminuje liniowe plazmidy. Mikroskopia z tagowanym locus pokazuje lokalizację i segregację po sprawdzeniu, że tag nie zmienia stabilności.

Curing przez zmianę warunku, zaburzenie Rep lub konkurencyjny replicon może skojarzyć utratę cząsteczki z fenotypem. Wycuringowany klon może jednak nabyć mutacje chromosomalne; potrzebne są ponowne wprowadzenie plazmidu i wiele niezależnych klonów.

Test transferu wymaga rozróżnienia dawcy, biorcy i transkoniuganta oraz potwierdzenia całej cząsteczki. Pojawienie się samego markera może wynikać z transpozycji. Częstość transkoniugantów w punkcie czasu nie jest bezpośrednio stałą szybkości, bo komórki równocześnie rosną i dalej transferują.

Jak śledzić plazmid w epidemiologii

Ten sam gen oporności może przemieścić się między plazmidami, a ten sam backbone zmienić cargo. Identyczny replicon type jest zbyt szeroki, by dowodzić transmisji konkretnej cząsteczki. Potrzebna jest zgodność całej sekwencji, struktury, złączy transpozonu i wariantów backbone.

Plazmid może rekombinować szybciej niż chromosom. Izolaty o odległych chromosomach mogą dzielić niemal identyczny plazmid, co wspiera HGT, ale źródło i kierunek wymagają czasu oraz epidemiologii. Bliskie chromosomy z różnymi plazmidami mogą reprezentować utratę lub nabycie w ognisku.

PTU, MOB i Inc służą do różnych skal. PTU grupuje całogenomowe podobieństwo, MOB aparat mobilizacji, Inc kontrolę replikacji/partycji. W raporcie warto podać wszystkie, zamiast zastępować je jednym „typem plazmidu”.

Najczęstsze błędy interpretacyjne

  1. „Plazmid jest małym kolistym DNA.” Może być bardzo duży lub liniowy.
  2. „Plazmid replikuje się niezależnie od komórki.” Ma własny replikon, ale korzysta z aparatu gospodarza.
  3. „Każdy pozachromosomowy element jest plazmidem.” Może być genomem faga, formą ICE lub produktem replikacji.
  4. „Episom to synonim plazmidu.” Oznacza zdolność do integracji i stanu autonomicznego.
  5. „Copy number jest stały dla szczepu.” Jest regulowanym rozkładem zależnym od warunku i komórki.
  6. „Wysokokopijny plazmid nie potrzebuje stabilizacji.” Multimery i koszt mogą nadal powodować utratę.
  7. „ParABS ciągnie plazmid po gotowym włóknie.” Cargo współtworzy dynamiczny gradient ParA na nukleoidzie.
  8. „TA zapobiega segregacji bez plazmidu.” Działa po utracie i zmienia sukces segreganta.
  9. „Każdy TA zabija komórkę.” Część hamuje wzrost, a wynik zależy od fizjologicznego poziomu.
  10. „Niezgodność oznacza podobieństwo całych plazmidów.” Wynika z konfliktu konkretnych systemów kontroli.
  11. „Koniugacyjny i mobilizowalny to to samo.” Mobilizowalny potrzebuje cudzego aparatu MPF.
  12. „Szeroki transfer host range oznacza szeroki replication host range.” Wejście i utrzymanie są osobnymi barierami.
  13. „Non-mobilizable nigdy się nie przenosi.” Może użyć cointegracji, transformacji lub transdukcji.
  14. „Gen oporności identyfikuje plazmid.” Ten sam transpozon występuje na różnych nośnikach.
  15. „Inc type jest taksonomią wszystkich plazmidów.” Obejmuje określony mechanizm i zakres baz.
  16. „Kolisty kontig jest na pewno pełnym plazmidem.” Trzeba sprawdzić złącze i biologiczny backbone.
  17. „Kontig z Rep jest plazmidem.” Rep może być fragmentem zintegrowanym lub błędną adnotacją.
  18. „Usunięcie antybiotyku usuwa oporność plazmidową.” Niski koszt, coselection i kompensacja mogą utrzymać cząsteczkę.
  19. „Obecność cargo gwarantuje fenotyp.” Liczy się allel, ekspresja, kopia i tło gospodarza.
  20. „Jedna kolonia reprezentuje stabilność populacji.” Potrzebna jest dynamika wielu pokoleń bez selekcji.

Jak raportować naturalny plazmid

Należy podać gospodarza do poziomu szczepu, metodę identyfikacji, pełną sekwencję i status domknięcia. Dla każdego replikonu warto raportować długość, topologię, GC, copy number wraz z mianownikiem, replicon/MOB/MPF/PTU oraz kompletność modułów.

Mapa powinna rozdzielać backbone, cargo i elementy mobilne. Trzeba podać granice transpozonów, orientację, miejsca złączeń oraz dowód, że gen i backbone leżą na tej samej fizycznej cząsteczce. Lista genów z osobnych kontigów nie wystarcza.

W doświadczeniu utrzymania należy określić liczbę pokoleń, brak lub rodzaj selekcji, sposób liczenia komórek z plazmidem i koszt markera. W transferze: donor, biorca, warunki kontaktu, mianownik, czas, wzrost i potwierdzenie transkoniugantów.

Host range trzeba nazwać precyzyjnie: transfer, replikacja czy długoterminowe utrzymanie. Wynik z panelu kilku gatunków nie jest pełnym zakresem. Brak transferu w jednym warunku nie dowodzi bariery absolutnej.

Dla ewolucji należy sekwencjonować plazmid i chromosom, rekonstruować mutacje oraz rozdzielać koszt, segregational loss i conjugation rate. Wzrost częstości plazmidu może wynikać z każdego z tych parametrów.

Granice tego artykułu

Ten tekst opisuje plazmid jako kompletny replikon: budowę modułową, replikację, copy number, partycję, niezgodność, mobilność i koszt. Transpozony, integrony, kasety i wyspy genomowe — elementy często stanowiące jego cargo — są tematem następnego artykułu.

Mechanizmy transformacji, transdukcji i koniugacji otrzymają osobne, porównawcze opracowanie. Tutaj koniugacja pojawia się tylko na tyle, by odróżnić plazmid samotransmisyjny od mobilizowalnego. Bariery restrykcja–modyfikacja i CRISPR również będą omówione oddzielnie.

Laboratoryjne wektory i kasety ekspresyjne opisuje serwis Genetyka. Naturalny plazmid może być przodkiem wektora, lecz jego ewolucyjne moduły, koszt i zakres gospodarzy nie są projektem zoptymalizowanym do klonowania.

Podsumowanie

Plazmid jest autonomicznie kontrolowanym replikonem zależnym od gospodarza. Jego backbone łączy oriV, kontrolę copy number, niekiedy partycję, resolution, mobilizację i stabilizację; cargo niesie warunkowe cechy. Moduły mają różne historie, więc jedna etykieta funkcjonalna lub jedno drzewo rzadko opisuje całość.

Theta, rolling circle, strand displacement i ColE1 reprezentują różne sposoby inicjacji. Ujemne sprzężenie przez Rep, iterony lub antysensowny RNA stabilizuje liczbę kopii. ParABS, ParMRC i TubZ segregują nieliczne kopie, a resolution zwiększa liczbę fizycznych jednostek. TA działa po utracie i nie powinien być automatycznie nazywany systemem zabijania.

Mobilność trzeba rozdzielić na koniugacyjność, mobilizowalność i brak znanego aparatu. Transfer host range nie jest replication ani maintenance host range. Klasy Inc, MOB, MPF i PTU opisują inne osie i razem lepiej oddają tożsamość plazmidu.

Trwałość w populacji wynika z utraty segregacyjnej, kosztu, transferu, selekcji cargo i kompensacyjnej ewolucji. Plazmid może pozostać bez pierwotnego selektora, a ten sam gen może zmieniać nośniki. Wiarygodna analiza wymaga domknięcia struktury, jednokomórkowego lub populacyjnego pomiaru kopii oraz potwierdzenia całego backbone, nie tylko markera.